تعیین مقدار ویتامین A

در ماده اولیه و روغن ماهی

پماد های چشمی و A+D

مقدمه : تعیین مقدار ویتامین A بعنوان ماده اولیه در برخی از پمادهای داروئی مانند ویتامین A چشمی و A+D در صنعت دارو از اهمیت ویژه ای برخوردار است .

با توجه به اینکه در کتابهای مرجع BP,USP و فارماکوپه اروپا روشی برای تعیین مقدار آن ذکر نشده  است ، در کارخانجات داروئی به روشهای مختلف تعیین مقدار می شود .

یکی از روشهای رایج استفاده از دستگاه HPLC است که در آزمایشگاه شرکت ایران ناژو از دستگاه HPLC  با مدل CECIL-1100 SERES استفاده شده است .

 

روش آزمایش :

فاز متحرک : متانل با HPLC Grade

محلول استاندارد :

آن مقدار از ویتامین A استاندارد را توزین نموده و به حجم برسانید که در نهایت دارای غلظت 85Iu/10ml باشد پس :

 Standard  : (85 Iu/10ml)

ويتامين A استاندارد اگر 1 miu/g باشد 85mg و اگر 1.7 miu/g باشد 50mg ، اگر  min 1.77 باشد 48mg و اگر 1.78 min/g باشد 47.753mg توزین کنید .

با توجه به واحد ویتامین A استاندارد ، مقدار لازم ر ا توزین کنید . و با هگزان - ايزوپروپيل الكل (50:50) به حجم 10 ml برسانيد و سه بار به نسبت 1/10 با ايزوپروپيل الكل رقت داده تا به غلظت 85 Iu/10ml برسد .

                             

 Test  : (85Iu/10ml)

1- پماد  (A+D):

هر 100 gr پماد A+D حاوي 85000 Iu ويتامين A است پس :

در يك بشر كوچك 1 gr از پماد را برداشته و در حدود 5 ml هگزان – ايزوپروپيل الكل (50:50) به آن اضافه كنيد و روي استيرر بگذاريد تا حل شود سپس به حجم 10 ml برسانيد و به مدت 5 دقيقه سونيكيت كنيد . پس از اینکه پایه پماد ته نشین شد سپس يكبار از محلول روئی به نسبت 1/10 رقت داده شود . پس از فيلتر كردن تزريق كنيد .

 

2-ويتامين A ماده اولیه :‌(85Iu/10ml)

ويتامين A اگر 1,7 min/gr باشد (بعنوان مثال) پس :

50mg از آن را با هگزان – ايزوپروپيل الكل به حجم 10ml برسانيد و سه بار به نسبت 1/10 با هگزان -ايزوپروپيل الكل رقت داده تا به غلظت 85Iu/10ml برسد .

3-Cod liver oil : (85Iu/10ml)

با توجه به برگه آناليز هر 1 gr روغن ماهي بطور متوسط اگر 1000 Iu ويتامين A داشته باشد پس 850mg آن 850 Iu دارد پس :

850 mg روغن ماهي را توزین کنید و در هگزان – ايزوپروپيل الكل حل كرده و به حجم 10 ml برسانيد و 2 دقيقه سونيكيت كنيد . 1 ml از آن را برداشته و با ايزوپروپيل الكل به حجم 10 ml برسانيد .

4- پماد سوختگي : (85Iu/10ml)

50% از پماد سوختگي را روغن ماهي تشكيل مي دهد.با توجه به برگه آناليز اگر هر يك گرم روغن ماهي 1000 Iu ويتامين A داشته باشد پس 50 gr آن 50000 Iu ويتامين A دارد .در واقع مي توان گفت هر 100 gr پماد سوختگي حاوي 50000 ويتامين A است. در نتيجه‌ 3.44 gr آن حاوي 1720 Iu ويتامين A است پس :

در يك بشر كوچك 3.44 gr از پماد را برداشته و در حدود 10 ml هگزان – ايزوپروپيل الكل (50:50) به آن اضافه كنيد و روي استيرر بگذاريد تا حل شود (15 دقیقه) سپس به حجم 20 ml برسانيد و به مدت 5 دقيقه سونيكيت كنيد پس از اینکه پایه پماد ته نشین شد 1ml از محلول روئی برداشته و با ایزوپروپیل الکل به حجم 10ml برسانید.

5-پماد چشمي : (85Iu/10ml)

هر 1 gr پماد چشمي 250 Iu ويتامين A دارد در نتیجه 680mg آن 170 Iu دارد پس :

در يك بشر كوچك 680mg از پماد را برداشته و در حدود 5 ml هگزان – ايزوپروپيل الكل (50:50) به آن اضافه كنيد و روي استيرر بگذاريد تا حل شود (15 دقیقه) سپس به حجم 10 ml برسانيد و به مدت 5 دقيقه سونيكيت كنيد . پس از اینکه پایه پماد ته نشین شد ، 5ml از محلول روئي برداشته و با ايزوپروپيل الكل - هگزان به حجم 10ml برسانيد . پس از فيلتر كردن تزريق كنيد .

پارامترهای روش HPLC :

 Flow rate    : 1  ml/min

wavelength : 320  nm   

Cloumn      : Nucleosil 100-5C8-25cm×4.6mm id 

Inj . vol.      : 20  µli

روش محاسبه :          

          

رنج قابل قبول : <765-935>       :     واحد ويتامين A در پماد ويتامين     (ru/rs)×  A+D(850 Iu/gr)

رنج قابل قبول : <992-1212>     :                         واحد ويتامين A (با توجه به برگه آناليز)×   (ru/rs)

رنج قابل قبول : <900-1100>      :             واحد ويتامين A در روغن ماهي(ru/rs)× (1000 Iu/gr)   

رنج قابل قبول :  <522-639>        :             واحد ويتامين A در پماد سوختگي   (ru/rs)×(580 Iu/gr)  

رنج قابل قبول :  <225-275>         :             واحد ويتامين A در پماد چشمي  (ru/rs)× (250 Iu/gr)  

 

مقایسه :

پیک ویتامین A در ماده اولیه ، روغن ماهی ، پماد چشمی و A+D با فاز متحرک متانل و در طول موج 320nm در کروماتوگرامهای زیر ارائه شده است :

 پیک 1-  پیک 2-  پیک 3- پیک 4-  پیک 5 - پیک 6 - پیک 7- پیک  8-

نتیجه :

تعیین مقدار ویتامین A در ماده اولیه و محصولات ذکر شده توسط HPLC به روش بالا دارای مزایای زیر  می باشد :

1-پمپ ها و ستون با فاز متحرک متانل به سرعت stable می شوند و میتوان آنالیز را سریعا شروع کرد .

2-خط زمینه در این روش noise بسیار کمتری دارد .

3-تفاوت Run time بین پیک حلال با پیک ویتامین A زیاد است در نتیجه تداخل کمتری دارند .

4-نتایج نسبت به روشهای دیگر تکرار پذیر و قابل اطمینان هستند .

 

خواهشمند است در صورت نیاز به اطلاعات بیشتر با شرکت ایران ناژو تماس حاصل فرمائید .

فرحناز حدید ساز : کارشناس ارشد شیمی - مسئول آزمایشگاه دستگاهی

دکتر مریم شهیدی : مدیر کنترل  کیفیت - جانشین مسئول فنی

معصومه میرزائی : کارشناس مسئول آزمایشگاه شیمی

 

 

Authors: F-Hadidsaz , M-Shahidi , M.Mirzai