مشكلات HPLC در يك پروسه آناليز :

 

در يك سيستم HPLC ، عوامل زيادي مي توانند اشكال ايجاد كنند . در ابتدا بايد مشكل را شناخت سپس به رفع آن اقدام ورزيد . با استفاده از جدول شماره 1 مشكل يا مشكلاتي را كه دركروماتوگرامها ايجاد مزاحمت مي كنند مشخص   كنيد . بنابراين با يك پروسه حذفي شما قادر خواهيد بود تا بصورت صحيح مشكل را رفع نمائيد .

 

چگونه از مزاحمت هاي فاز متحرك (M.ph) جلوگيري كنيم :   

حساسيت پائين و بالابودن خط زمينه Baseline) ( ، اغتشاش يا برآمدگي روي كروماتوگرام ، غالبا مي تواند مربوط به فاز متحرك باشد . آلودگي در فاز متحرك ممكن است باعث بالارفتن baseline شود و نادرست بودن پيك مي تواند بعلت افزايش  ناخالصي در فاز متحرك باشد .

 آب مي تواند بزرگترين منبع آلودگي در فاز متحرك باشد شما بايد هنگام درست كردن فاز متحرك فقط از آب مقطر كاملا خالص يا يونيزه شده استفاده كنيد . براي از بين بردن اين آلودگي ها بايد آب يونيزه شده را از ميان زغال فعال شده يا يك غشاء C18 عبور داد .

تنها از حلال ها ، نمك ها يا معرف هاي زوج يوني و ... كه مخصوص HPLC هستند استفاده كنيد. از حلال هاي با كيفيت پائين استفاده نكنيد ، زيرا اثرات آلوده كننده ها غالبا باقي مي ماند و زمانيكه شما از يك دتكتور با حساسيت بالا استفاده مي كنيد ، اين اجزاء مي توانند ايجاد مزاحمت كنند . براي از بين بردن حباب ها در سيستم ، فاز متحرك را متناوباً گاززدائي نمائيد . پس از آماده كردن فاز متحرك آنرا از فيلتر 0.45 يا 0.2 ميكرون عبور دهيد . اين فيلتر ها علاوه بر گاززدائي باعث حذف ذراتي مي شوند كه عامل ايجاد اغتشاش در baseline هستند .

در ساخت فاز متحرك ، بايد نسبت ها رعايت شود و بايد كاملاً مطمئن شد كه نسبت ها درست هستند و از حلالي استفاده كنيد كه حد واسط قطبيت را داشته باشد .

از آنجائيكه بسياري از بافرهاي آبي باعث رشد باكتريها مي شوند با تهيه محلولهاي تازه ميتوان قوياً از رشد آنها جلوگيري بعمل آورد . با افزودن در حدود 100ppm از سديم آزيد (azid sodium)  به محلول بافر آبي از رشد ميكروارگانيسم ها   جلوگيري بعمل آوريد . يا  مي توان اين بافرها را با حلال هائي مانند استونتيريل مخلوط كرد.

در هنگام استفاده از واكنشگرهاي زوج يوني با دقت عمل كنيد و بايد بهترين غلظت و طول زنجير اين واكنشگرها براي هر آناليز مشخص شود . معمولا افزايش غلظت يا افزايش طول زنجير باعث افزايش زمان بازدارنده (retention time)   مي شود . پيشنهاد مي كنيم از غلظتهاي 0.2 تا 10mM استفاده كنيد .

 

غلظتهاي بالاي (>50%) استونيتريل و ديگر حلال هاي آلي مي توانند باعث رسوب و اكنشگرهاي زوج يوني شوند .

زمانيكه شما بخواهيد از يك تركيب براي بهبود آناليز بعدي استفاده كنيد اصلاح كننده هاي فراري مانند تري اتيل آمين مفيد هستند . اين اصلاح كننده ها هم چنين به شما كمك مي كنند تا از مشكلاتي كه واكنشگرهاي زوج يوني ايجاد مي كنند اجتناب كنيد . آنها را مي توان به بافرهاي با غلظتهاي   0.1% تا 1% اضافه كرد . افزايش غلظت آنها باعث بهبود شكل پيك درتركيبات پايه مي شود اما مي توانند باعث تغيير  retention time شوند . اخيرا مطالعات نشان مي دهد كه چرخش مداوم فاز متحرك مورد استفاده براي جداسازي باعث طولاني تر شدن  عمر ستون مي شود ولي باعث كاهش ارزش حلال مي گردد. در اين صورت شما بايد كاهش تدريجي base line را كه معمولا اتفاق مي افتد ثبت كرده و در انتگرال گيري دخالت دهيد . بخاطر داشته باشيد در يك  پروسه آناليز اجزاء فرار بخار مي شوند بخصوص زماني كه بطور متناوب گاززدائي مي شوند و اين امر ، تركيب M.ph را تغيير مي دهد .

 

مشكلات پمپ ها در جداسازي :

يك پمپ بايد جريان ثابتي از حلال را در شرايط مختلف از ستون عبور دهد . پمپ هاي جديد به گونه اي طراحي   شده اند كه شامل سرنگ ، دياگرام ، پيستون يا تركيبي از آنها است .

مشكلات پمپ ها معمولا آسان و قابل تصحيح هستند . برخي از آنها باعث بي نظمي در retention time ، اغتشاش روي base line يا شكافتگي روي كروماتوگرامها مي شوند . اختلال در كار پمپ اثر ضعيفي روي كروماتوگرام دارد . يك نوع علامت نشتي اين است كه نمك هاي موجود در محل اتصالات پمپ ، خود را نشان مي دهند . وجود نشتي در پمپ ممكن است احتياج به جابجايي قطعات در دستگاه داشته باشد . بعضي از  اشكالات هم خاص دستگاه شما مي باشد پس بايد از دستورالعمل رفع مشكلات استفاده نمائيد .

 

محل تزريق (Injector) و حلال هاي تزريق شده :

Injector بسرعت نمونه را با كمترين flow وارد سيستم مي نمايد . در سيستم هاي HPLC نوع سرنگ ، Loop و  fixed Loop مي تواند متفاوت باشند . اين مجموعه مي تواند بصورت دستي ، با هواي فشرده يا الكتريكي باشد .

مشكلات مكانيكي مربوط به injector (مانند چكه كردن ، نشتي يا ...) نسبتاً آسان و قابل تصحيح هستند . مشكلات ديگر كه بر اثر افزايش تعداد تزريق ايجاد مي شوند بيشتر مربوط به حلاليت است . علاوه بر اينها گاهي اوقات مي توان آنها را به خود injetor نسبت داد .

تغيير درارتفاع پيك ها ، شكافتگي پيك ها و پهن تر شدن پيك ها مي تواند كاملا مربوط به گرفتگي محل تزريق   نمونه باشد .

 

 

  

بنابراين مخلوط نشدن كامل فاز متحرك با حلال و يا حلاليت كم نمونه در M.ph مي تواند باعث گرفتگي محل تزريق شود . به عبارتي بايد مطمئن شويد كه قدرت شويندگي فاز متحرك بيشتر از حلال باشد (جدول 3).

 

محافظت از ستون :

اگرچه فيلتر كردن فاز متحرك ، همسو بودن فيلتر ها ، اشباع بودن ستون و گاردستون قسمت مهمي از دستگاه نيستند اما بخش بزرگي از مشكلات همراه با جداسازي را كاهش مي دهند .

فيلتر ها و محافظ ستون از ورود ذرات به ستون جلوگيري مي كنند و از تجمع ذرات درستون هم قوياً جلوگيري مي كنند . ذرات سيليكا موجود در ساختار يك ستون ، درفاز متحرك حل نمي شود واز پايه سيليكا موجود در ساختار ستون نيز محافظت مي كنند .

عمر مفيد اين ذرات به فاكتورهاي زيادي بستگي دارد كه شامل تركيب فاز متحرك ، خلوص نمونه ، PH و ...... دارد . بنابراين مجموع اين عوامل مي توانند باعث گرفتگي ذرات درستون ، كاهش فشار پمپ ، پهن شدن پيك ها يا شكافتگي در پيك شوند .

 

بدست آوردن اطلاعات بيشتر از ستون :

ستونها در سايز ها و طرحهاي مختلف طراحي شده اند . رنج وسيعي از پركننده هاي ستون قابل دسترسي هستند كه كاربرد همه آنها درنهايت ، جداسازي است . بيشترين وجه اشتراك مشكلات ايجاد شده در ستون مربوطه به زوال تدريجي آن است .

   كاهش عمر مفيد ستون باعث ضعيف شدن پيك ها ، شكافتگي پيك ها ، شانه دارشدن پيك ها ، كم شدن Resolution ، كاهش زمان بازدارنده و بالارفتن فشار برگشتي (back pressure) است . اين عوامل نشان دهنده      آلودگي هايي هستند كه در ستون جمع شده اند و باعث تغيير در فشردگي (Packing) آن شده اند .

اين آلودگي بيشترين تاثير را در بازدهي ستونها مي گذارند . بعنوان مثال بازدهي يك ستون با فشردگي 3 ميكرون به 0.5 ميكرون كاهش پيدا مي كند و فشردگي 5 تا 10 ميكرون به 2 ميكرون يا بيشتر كاهش پيدا مي كند .

محافظت درست از ستون و محلول سازي به روش صحيح باعث افزايش كارآيي بيشتر ستون مي شود . تداخل و   همپوشاني ذرات در يك ستون مي تواند باعث تشكيل پيك هاي ضعيف و مشكلات ديگر شود . ظرفيت ستونها بستگي به عوامل بسياري دارد اما متداولترين آنها عبارتند از :

 

 

 

 

Analyltical Column

(25cm×4.6mm)<500µg

Semi-Preparative Column

(25cm×10mm)<100mg

Preparative column

(25cm× 21.2mm)<500mg

مشكلات مربوط به دتكتورها : 

بيشتر از 20 نوع دتكتور در سيستمهاي HPLC وجود دارد . متداولترين آنها ، فوتومترهاي UV با طول موجهاي مختلف و دتكتورهاي refractive index هستند . دتكتورهاي الكتروشيمي و هدايت سنجي هم عموعاً متداولند. پيشرفت در تكنولوژي سل دتكتورها ، استفاده از آنها را آسانتر كرده است .

مشكلات دتكتور را مي توان به دو دسته الكتريكي و مكانيكي - نوري تقسيم كرد . براي رفع مشكلات مربوط به بخش الكتريكي دتكتور ، بايد با دستورالعمل دستگاه آشنا بود . مشكلات نوري يا مكانيكي معمولا به جريان سل مربوط مي شود . مشكلات مربوط به دتكتور شامل نشتي ها ، حباب هاي هوا و آلودگيهاي سل است . اين عوامل معمولاً باعث ايجاد اغتشاش روي خط زمينه كروماتوگرام مي شوند .

بعضي از مواد سل (خصوصاً در دتكتورهاي (Refractive به فشارهاي بالا حساس هستند . هرگاه سرعت فاز متحرك (flow rate) يا فشار معكوس (back pressure) از ميزان ذكر شده در كاتولوگ دستگاه بيشتر باشد ، پنجره سل را خواهد شكست . لامپ هاي كهنه، باعث افزايش زمان ، كاهش حساسيت و كاهش ارتفاع پيك مي شوند . اشتباه در وصل كابل هاي برگشتي نيز باعث بروز مشكلاتي مي شود .

 

گرم كننده ستون ، ثبات

اين اجزاء بندرت براي سيستم ، مشكل ايجاد مي كنند اين موارد در جدول شماره 1 عنوان شده است .

 

صحت نتايج

همه مشكلات يك شبه پديدار نمي شوند اما بتدريج توسعه پيدا مي كنند . پس حفظ صحت نتايج . حياتي است و بسياري از مشكلات را حل مي كند . ارزيابي كار هر ستون با شماست . زمانيكه قادر به ارزيابي بوديد مي توانيد بطور صحيح مشكلات را حل كنيد . شما مي توانيد اطلاعات مربوط به تاريخچه بازدهي ستون ، فاز متحرك استفاده شده ، جريان لامپ ، كارپمپ و غيره ، را از مانيتور كامپيوتر سيستم تان دريافت كنيد .

با كمك ثبات ها مي توان از اشتباهات جلوگيري بعمل آورد . به عنوان مثال مي توان مانع ورود آب در داخل يك ستون سيليكا يا رسوب كردن بافر در يك سيستم شد . بسياري از شيميدانها سيستمهاي HPLC را تغيير مي دهند .

ثبات ها بهترين روش براي نشان دادن تغييرات در سيستم هستند . براي مشكلات مربوط به پمپ ها ، دتكتورها ، Injector و اطلاعات سيستم ، از اين راهنما استفاده كنيد .

 

 

 

 

فهرست مشكلات

شماره اشكال                 اشكال

شماره اشكال                 اشكال

شماره اشكال                 اشكال

 

 

پيكها

19

شبه پيك ها

Baseline

16

تغييرات درارتفاع

 

انواع پيك هاي دفرمه شده

12

 

            

برآمدگي

15

پهن شدن

 

14

 

غيرعادي بودن –اغتشاش

2

گم شدن پيك

10

15

( (Frontingكاهش تفكيك پيك

 

13

 

عادي بودن –اغتشاش

18

منفي شدن

7

گردشدن

1

عدم مشاهده پيك

 8,9

 

شكافتگي

دنباله دارشدن

 

 

 

فشار پشت ستون

 

 

6

عدم تفكيك پيك ها

5

تغييرات زمان بازدارنده

4

بيشتر از حد معمول

17

تغييرات حساسيت

 

5

 

 

كمتر از حد معمول

 

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1-مشكلات HPLC و طريقه رفع اشكال

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 1

1-لامپ دتكتور را روشن كنيد.

 

2-محل اتصالات و كابلها را چك كنيد .

 

 

 

3-مشكل شماره 2 را ببينيد .

 

4-بايد مطمئن شويد كه باندازه كافي‎،  نمونه تزريق شده است . با يك محلول استاندارد تازه تهيه شده سيستم را ارزيابي كنيد تا نمونه بعنوان منبع مشكل تأييد شود .

 

5-تنظيمات دستگاه را به گونه اي انجام دهيد كه ثبات قادر به رسم كروماتوگرام باشد.

1-لامپ دتكتور خاموش است.

 

2-وجود نشتي يا شكستگي در لوله رابط بين دتكتور و محل تزريق يا دتكتور و ثبات .

 

3-عدم وجود جريان فاز متحرك .

 

4-نمونه اي وجود ندارد يا نمونه از بين رفته است .

 

 

 

5-وجود تنظيمات خيلي بالا روي دتكتور يا ثبات .

عدم مشاهده پيك / پيكهاي خيلي كوچك.

 

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 2

1-پمپ را روشن كنيد .

 

2-سطح فاز متحرك را در منبع كنترل كنيد. جريان خروجي سيستم و محل تزريق نمونه را از نظر گرفتگي هوا كنترل كنيد. اطمينان حاصل كنيد كه فيلتر خروجي فاز متحرك تميز است . مطمئن شويد كه اجزاء فاز متحرك كاملا گاززدائي شده است .

 

3-سيستم و پمپ را براي نشتي كنترل كنيد زيرا پيك هاي موجود در محل نشتي اغتشاش هاي غير معمول ايجاد مي كنند . اگر لازم بود اتصالات پمپ را عوض كنيد .

 

4-محل اتصال لوله به گارد ستون را اگر موجود است باز كنيد . سرعت جريان فاز متحرك را كنترل كنيد.پمپ را تحت Flow rote بالا حدود10ml/min ، Purge كنيد.در صورت لزوم پمپ ها را يكي يكي Purge كنيد . اگر پمپ ها شيرخروجي هوا دارند ،هوا را از طريق آنها خارج كنيد . اگر مشكل رفع نشد و هوا خارج نشد سيستم را با متانول 100% بشوئيد . اگر بازهم رفع نشد با كارخانه سازنده تماس بگيريد .

1- خاموش بودن پمپ

 

2-اختلال در جريان –انسداد يا گرفتگي .

 

 

 

 

 

 

3-نشتي

 

 

 

 

 

4-به علت نوسانات فشار ، هوا در سر پمپ به دام افتاده است .

 

 

 

 

 

 

عدم وجود جريان .

 

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                        

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 3

1-سيستم را كنترل كنيد.پمپ ها را براي نشتي ، وجود نمك و اغتشاشات غير معمول چك كنيد . اتصالات پمپ را اگر لازم بود تغيير دهيد .

2-سطح فاز متحرك را در ظرف مخصوص آن كنترل كنيد كه بالاي سطح فيلتر ها باشد . محل تزريق نمونه را براي مسدود شدن يا گرفتگي توسط حبابهاي هوا چك كنيد . اطمينان حاصل كنيد كه فيلتر داخلي فاز متحرك تميز است و مطمئن شويد كه اجزاء فاز متحرك كاملا با هم مخلوط و بطور صحيح گاززدائي شده است .

3-لوله محل اتصال را باز كنيد و جريان فاز متحرك را كنترل كنيد . اگر لازم باشد در flow rate بالا (10ml/min) پمپ را Purge كنيد .اگر سيستم داراي شيرخروجي هوا است  اجازه دهيد هوا خارج شود .

4-دوباره ستون را وصل كنيدو       flow rate حلال را روي 1-2ml/min قرار دهيد . اگر فشار هنوز كم است نشتي ها را در محل اتصالات چك كنيد.

5-ستون و محافظ آن را باز كرده و سيتم را Purge كنيد . اگر مشكل رفع نشد با متانل 100% ، Purge كنيد .

6-اتصالات را عوض  كنيد .

1-نشتي

 

 

 

2-تداخل در جريان فاز متحرك مانند مسدود شدن

 

 

 

 

 

 

 

3-بدام افتادن هوا در سرپمپ (بعلت نوسانات فشار)

 

 

 

 

4-نشتي در انتهاي اتصال ستون

 

 

 

5-هوا در مكانهايي از سيستم بدام افتاده است .

 

6-محل اتصالات در اطراف سرپمپ مسدود شده اند . 

فشاري وجود ندارد يا فشار پائين تر از حد معمول است .

 

 

 

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                        

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 4

1-گارد را باز كنيد و ستون را تحت فشار 2-5ml/min قرار دهيد . اگر فشار كاهش يافت علت شماره 2 را بررسي كنيد . در غير اينصورت به صورت سيستماتيك با حذف يك به يك عوامل سيستم ، پي به علت افزايش فشار ببريد.  براي كاهش فشار كار را با دتكتور شروع كنيد .

2-گارد را عوض كنيد (اگر ستون گارد داشته باشد)و فشار را چك كنيد . در صورت لزوم دوباره گارد را سرجايش قرار دهيد. اگر ستون بواسطه آناليتيكي مسدود شده است ، ستون را برعكس كرده تا در ستون توازن برقرار شود . اگر باز مشكل باقي ماند ستون ممكن است قويا آلوده شده باشد . بنابر اين از دستورالعمل مناسب استفاده كنيد. (جدول 2 صفحه 19). اگر باز مشكل رفع نشد ورودي ستون را تغيير دهيد يا ستون را عوض كنيد.

1- اشكال از پمپ – محل تزريق يا از لوله ها ست .

 

 

 

 

 

 

2-مسدود بودن گارد يا ستون

فشار بالاتر از حد معمول

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 5

1-اتصالات سيستم را كنترل كنيد. پمپ را براي نشتي ها ،گرفتگي با نمك و اغتشاشات غير معمول كنترل كنيد .

 

2-فرمول تركيب فاز متحرك را كنترل كنيد. اگر فاز متحرك بصورت مكانيكي مخلوط مي شود شما همان فاز متحرك را بصورت دستي مخلوط كنيد .

 

3-هوا را از پمپ ها Purge كنيد . يا از شيرهاي خروجي استفاده كنيد . اگر لازم شد اتصالات پمپ را عوض كنيد . از گاززدائي فاز متحرك اطمينان حاصل كيند .

 

4-از ستون آون دار استفاده كنيد  (توجه داشته باشيد كه درجه حرارتهاي بالاتر در ستون، بازدهي مؤثر را براي جداسازي كاهش مي دهد . براي بدست آوردن بهترين نتيجه  فاز متحرك را قبل از ورود به ستون       مي توان گرم كرد).

5-حجمهاي كوچكتري را تزريق كنيد (بعنوان مثال µli 10 نسبت به (100µli يا حجم نمونه را به نسبت 1:10 و 1:100 رقيق كنيد .

6-حلال را تنظيم كنيد. اگرچه مي توان از فاز متحرك هم بعنوان حلال نمونه استفاده كرد .

7-بايد ستون جديدي جايگزين ستون قبلي شود.اگر مي توانيد ستون قديمي را احياء كنيد .(صفحه 19را ببينيد).

1-نشتي ها

 

 

 

2-تغيير در تركيب اجزاء فاز متحرك (كوچكترين تغييرات در تركيب اجزاء فاز متحرك مي تواند باعث تغييرات زيادي در زمان بازدارنده شود ).

 

3-هوا در پمپ بدام افتاده است (در نتيجه زمان بازدارنده افزايش و كاهش مي يابد ).

 

 

4-نوسانات درجه حرارت ستون ، باعث ايجاد اين تغييرات مي شود (خصوصاً در تبادلات سيستمهاي تعويض يوني ).

 

 

 

5-افزايش بار ستون (درصورتيكه جرم محلول تزريق شده بالاتر از ظرفيت ستون باشد زمان بازدارنده معمولاً كاهش پيدا مي كند ) .

6-حلال نمونه با فاز متحرك  سازگار نيستند .

 

7-ستون مشكل دارد (نه بعنوان يك عامل عمده در بي نظمي زمان بازدارنده،بلكه با افزايش طول عمر ستون معمولا زمانهاي بازدارنده كاهش مي يابد ). 

تغييرات در زمان هاي بازدارنده

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 6

1-فرآيند ساخت فاز متحرك را كنترل كنيد (صفحه 2) .

 

2-گاردستون را اگر موجود است باز كنيد و دوباره عمل آناليز را شروع كنيد .

در صورت لزوم گارد ستون را دوباره قرار دهيد . اگر ستون مسدود است آن را برگردانيد و تراز كنيد  . اگر مشكل رفع نشد ستون باحتمال زياد آلوده شده است پس از دستورالعمل مناسب استفاده كنيد(جدول 2صفحه 19) اگر باز هم رفع نشد ستون را عوض كنيد .

1-آلودگي فاز متحرك يا تغيير كيفيت آن به مرور زمان باعث تغيير زمان بازدارنده مي شود.

2-گارد يا ستون آناليتيكي مسدود شده است .

عدم تفكيك پيك ها

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مشكل شماره 7

1-گاردستون را اگر موجود است برداريد و دوباره عمل آناليز را شروع كنيد .

در صورت لزوم گارد ستون را عوض كنيد . اگر ستون مسدود است آن را برگردانيد و تراز كنيد  . اگر مشكل رفع نشد ستون باحتمال زياد آلوده شده است.پس از دستورالعمل مناسب استفاده كنيد(جدول 2صفحه 19) اگر باز هم رفع نشد ستون را عوض كنيد .

2-حلال را تنظيم كنيد . اگر چه       مي توان از فازمتحرك هم بعنوان حلال نمونه استفاده كرد .

1-آلودگي روي گارد ستون يا حلقه ورودي ستون

 

 

 

 

 

 

 

2-حلال نمونه با فاز متحرك سازگار نيست .

شكافتگي در پيك ها

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 8

1-نحوه عملكرد ستون را با استاندارد ها كنترل كنيد .

2-انواع ديگر ستون را امتحان كنيد (بعنوان مثال ستون بي اثر يا خنثي براي تركيبات پايه )

 

3-PH را تنظيم كنيد . معمولا براي تركيبات پايه، بيشتر پيك هاي متقارن در PH پائين ايجاد مي شوند.

 

4-واكنشگرهاي زوج يوني يا اصلاح كننده هاي فرار اضافه كنيد (صفحه 3) .

1-تداخل درنمونه

 

2-اشتباه در تعيين نوع ستون

 

 

 

3-اشتباه در تعيين PH فاز متحرك

 

 

 

4-نمونه با سايت هاي فعال واكنش مي دهد .

دنباله در ابتدا يا انتهاي پيكها

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 9

1-نحوه عملكرد ستون را با استاندارد ها كنترل كنيد .

2-ساخت فاز متحرك را كنترل كنيد.(صفحه 2)

3-گارد ستون را اگر هست عوض كنيد و دوباره آزمايش كنيد. درصورت لزوم دوباره گارد ستون را بگذاريد و اگر ستون عامل مشكل است از دستورالعمل مناسب استفاده كنيد (جدول 2-صفحه19).اگر مشكل رفع نشد ستون را عوض كنيد .

1-تداخل در نمونه

 

2-آلودگي فاز متحرك يا تغيير كيفيت آن به مرور زمان

3-ستون يا گارد آلوده شده است يا كهنه شده است .

ايجاد دنباله در پيك هائي كه قبلا متقارن بودند .

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                    

 

 

 

  

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 10

1-نحوه عملكرد ستون را با استاندارد ها كنترل كنيد .

2-كارائي ستون  را افزايش دهيد يا حساسيت را اينقدر تغيير دهيد تا تفكيك پيك ها از هم بهبود يابد . سعي كنيد از نوعهاي ديگر ستون هم استفاده كنيد (مانند ستون غيرقطبي C18 تا ستوني با فاز قطبي سيا نو) .

 

3-حجمهاي كوچكتر تزريق كنيد (مانند 10µli در مقابل 100µli )يا 1:10 نسبت به 1:100 از حجم نمونه .

4-حلال را تنظيم كنيد. مي توان نمونه ها را در فاز متحرك تزريق كرد . قطبيت پيوندها در فاز ساكن را با 200ml اتيل استات مخصوص HPLC تنظيم كنيد (2.5ml/min) . سپس با حلالي با  قطبيت حد واسط آناليز را ادامه دهيد .

1-تداخل در نمونه

 

2-شانه دار شدن يا بالا آمدن تدريجي خط زمينه قبل از پيك اصلي ممكن است مربوط به اجزاي ديگر نمونه باشد .

 

 

 

3-افزايش بار ستون

 

 

4-حلال نمونه با فاز متحرك تداخل دارد .

 

كاهش تفكيك پيك ها

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                                                    

 

 

 

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 11

1-حجم يا غلظت نمونه را كاهش دهيد.

 

2-حساسيت را تنظيم كنيد .

3-حجمهاي كوچكتر از نمونه را تزريق كنيد.(بعنوان مثال 10µli نسبت به 100µi)يا به نسبت 1:10 و 10:100 از حجم نمونه را رقيق كنيد .

4-قدرت بافر،PH يا تركيب فاز متحرك را تغيير دهيد . اگر لازم شد درجه حرارت ستون را بالا ببريد يا نوع ستون را عوض دهيد (آناليز ساختار محلول ممكن است نوع تداخلات را پيش بيني كند ).

5-ثابت ها را به گونه اي به پائينترين مقدار كاهش دهيد تا در آناليزهاي بعدي مشكلي ايجاد نكنند .

 

1-عملكرد دتكتورخارج از رنج خطي ديناميكي است .

2-حساسيت ثبات خيلي پائين است

3-بار ستون زياد است .

 

 

 

4-تداخل بين ستون و نمونه

 

 

 

 

5-ثابت هاي زماني دتكتور يا ثبات خيلي بالا است .

 

گردشدن پيكها

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

مشكل شماره 12

1-درجه حرارت ستون و فازمتحرك را كنترل كنيد . از آون حرارتي قبل از دتكتور استفاده كنيد .

 

 

 

2-از حلال ها ، نمك هاي با درجه خلوص بالاو افزودني هاي مخصوص HPLC استفاده كنيد . فاز متحرك را قبل از استفاده گازدائي كنيد .مي توان از گاز هليم هم براي گاززدائي استفاده كرد.

1-ايجاد نوسانات در درجه حرارت ستون (حتي كوچكترين تغييرات در درجه حرارت ستون باعث ايجاد اين نوسانات مي شود.غالبا بازتابش و هدايت دتكتور ها هم عامل ايجاد اين نوسانات است ).

2-يكنواخت نبودن فاز متحرك (اين حالت معمولا درجذب هاي بالا ايجاد مي شود اما برآمدگي خط زمينه ترجيحا از نوسانات درجه حرارت است).

برآمدگي baseline

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                    

 

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 12

3- سل را با متانل يا حلالهاي قوي ديگر متعادل كنيد . اگر لازم شد سل را با HNO3 1N شستشو دهيد . (هرگز با HCL اين عمل را انجام ندهيد).

4-مسير مسدود شده را باز يا عوض كنيد .به دستورالعمل دتكتور براي تعويض پنجره سل مراجعه كنيد .

 

 5-تركيب فاز متحرك يا Flow rate را تصحيح كنيد سعي كنيد از مشكلات ساده مانند تركيب فاز متحرك يا سرعت    Flow rate اجنتاب كنيد .

6-ستون را با يك حلال حدواسط قوي به تعادل برسانيد ،سپس با 10الي 20 حجم از فازمتحرك جديد ستون را قبل از شروع كار آماده آناليز كنيد .

7-مراحل ساخت فازمتحرك را كنترل كنيد.(صفحه2)

 

 

8-از گاردستون استفاده كنيد و اگر لازم شد ستون را با حلالهاي قوي در فواصل بين شستشو متعادل كنيد يا عمل آناليز را متناوبا و دوره اي انجام دهيد .

 

 

9-baseline را متوقف كنيد . زماني از مواد جديد استفاده كنيد كه رنج ديناميكي دتكتور اضافه شده باشد (صفحه 3)

10-ماكزيمم طول موج جذب UV را تغيير دهيد .

3-آلودگي يا وجود هوا در سل دتكتور .

 

 

 

4-مسدود شدن مسير خروجي بعد از دتكتور باعث ترك برداشتن پنجره سل مي شود در نتيجه در baseline ايجاد اغتشاش مي كند.

5-اشكالي در مخلوط كردن فازمتحرك بوجود آمده يا تغيير در Flow rate ايجاد شده است .

 

6-تعادل در ستون به آهستگي صورت مي گيرد خصوصا زمانيكه فاز متحرك را تغيير مي دهيد .

 

7-فازمتحرك آلوده شده است ،يا تاريخ مصرف آن گذشته است يا براي ساخت آن از موادي با كيفيت پائين استفاده شده است .

8-اجزائي در نمونه كه سرعت مهاجرت آنها در ستون كم است (k` بالا) باعث ايجاد پيكهاي خيلي پهن در baseline مي شود كه بنظر  مي رسد baseline به سمت بالا كشيده     مي شود يا شكم داده است .

9-جريان فاز متحرك برقرار است. اما دتكتور تنظيم نيست .

 

10-دتكتور(UV) در ماكزيمم مقدار جذب تنظيم نيست اما در شيب منحني قرار دارد .

 

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 13

1-فاز متحرك را گاززدائي كنيد .سيستم را با خروج هوا از سل دتكتور يا پمپ به تعادل برسانيد .

 

2-اتصالات سيستم را كنترل كنيد . پمپ را براي نشتي ها ، گرفتگي با نمك كنترل كنيد،كه باعث اغتشاشات غيرمعمول مي شود . اتصالات پمپ را اگر لازم شد عوض كنيد .

 

3-فازمتحرك را با دست مخلوط كنيد  يا از حلال هايي با ويسكوزيته پائينتر استفاده كنيد .

 

4-اختلاف دما را كاهش دهيد يا تبادل حرارت را افزايش دهيد .

 

5-در صورتيكه منبع مشكل،از خارج سيستم  است LCو دتكتور و ثبات را يكي يكي  جدا كنيد .

 

6-نوسانات پمپ را به كمترين مقدار كاهش دهيد .

1-وجود هوا در فازمتحرك ، سل دتكتور يا پمپ

 

 

2-وجود نشتي در سيستم

 

 

 

 

 

3-فازمتحرك خوب مخلوط نشده است.

 

 

4-اثر درجه حرارت ( درجه حرارت ستون بالا است اما دتكتور گرم نيست).

 

5-تأثير عملكرد ديگر وسايل الكترونيكي روي baseline

 

 

6-نوسانات پمپ

 

اغتشاش منظم در خط زمينه

 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 14

1-سيستم را در قسمت اتصالات كنترل كنيد .پمپ را براي نشتي ها ، گرفتگي با نمك و اغتشاشات غيرمعمول كنترل كنيد .

 

2-ساخت فازمتحرك را كنترل كنيد . (صفحه 2) .

 

 

 

3-دتكتور و ثبات را جدا كنيد . براي رفع اشكال به دستورالعمل دستگاه مراجعه كنيد .

 

4-سيستم را با حلال قوي به تعادل برسانيد.

 

5-دتكتور را Purge كنيد . يك وسيله برگشت فشار بعد از دتكتور نصب كنيد .

 

6-سل را تميز كنيد .

 

 

 

7-لامپ را عوض كنيد .

 

8-ستون را عوض كنيد .

 

1-نشتي

 

 

 

 

2-فازمتحرك آلوده شده است يا زمان مصرف آن گذشته است يا از موادي با كيفيت پائين ساخته شده است .

 

3-اشكال الكترونيكي در دتكتور يا ثبات

 

 

4-هوا در سيستم بدام افتاده است .

 

 

5-وجود حبابهاي هوا در دتكتور

 

 

6-سل دتكتور آلوده شده است (حتي مقادير بسيار كم آلودگي نيز ميتواند باعث ايجاد اغتشاش شود ).

 

7-لامپ دتكتور ضعيف شده است .

 

8-ايجاد ترك در سيليكاي ستون يا مواد فشرده شده درون ستون

اغتشاش نامنظم baseline

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 15

1-فازمتحرك جديدي درست كنيد .

 

2-Flow rate را تنظيم كنيد.

 

3-سيستم را در قسمت اتصالات كنترل كنيد پمپ را براي نشتي ها گرفتگي با نمك و اغتشاشات غيرمعمول كنترل كنيد . اگر لازم شد اتصالات پمپ را عوض كنيد .

 

4-تنظيمات دتكتور را تصحيح كنيد .

 

5-

a: حجمهاي كوچكتر را تزريق كنيد (بعنوان مثال 10µli در مقابل 100µli )يا 1:10 و 1:100 از حجم نمونه را رقيق كنيد.

b: زمان (t) را كاهش دهيد يا از سل كوچكتر استفاده كنيد .

c: از اتصالات كوتاهتر يا از يك قطعه ID 0.007-0.010 بطور تجربي استفاده كنيد .

d: زمان (t) را كاهش دهيد .

 

6-غلظت بافر را افزايش دهيد .

 

7-گارد ستون را عوض كنيد .

1-تركيب فازمتحرك تغيير يافته است.

2-جريان فازمتحرك خيلي پائين است.

3-وجود نشتي(خصوصاً بين ستون و دتكتور)

 

 

 

 

4-نادرست بودن تنظيمات دتكتور

 

5- تأثير عوامل بيروني بر ستون

a: اضافه بار ستون

 

 

 

b: حجم سل يا زمان (t) در دتكتور خيلي بزرگ است .

c: اتصالات بين ستون و دتكتور خيلي طولاني است يا ID خيلي بزرگ است .

d: زمان (t) ثبات خيلي بالاست .

 

6-غلظت بافر خيلي كم است .

 

7-گارد ستون آلوده يا كهنه شده است .

پهن شدگي پيك ها

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

رفع اشكال

علت اشكال

مشكل

مشكل شماره 15

8-ستون را با نوع جديد و مشابهي از آن عوض كنيد . اگر ستون جديد پيك هاي متقارن داد پس ستون قديمي را احياء كنيد (جدول 2 صفحه 19) . مجدداً آناليز را شروع كنيد .

9-خروجي انتهاي ستون را باز كرده و فضاي خالي را پر كنيد .يا ستون را عوض كنيد .

 

10-نوع ستون را عوض كنيد تا جداسازي بهبود يابد .

 

11-درجه حرارت را افزايش دهيد نبايد بيشتر از 75ºc شود . مگر اينكه در مونوگراف ستون درجه حرارتهاي بالاتر ذكر شده باشد .

8-ستون آلوده يا كهنه است .

 

 

 

 

9-وجود فضاي خالي در ورودي ستون

 

 

10- پيك بصورت دو يا چند پيك نسبتاً ضعيف نمايش داده مي شود .

 

11-درجه حرارت ستون خيلي پائين است .

 

 

 

 

 

 
 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

خواهشمند است در صورت نیاز به اطلاعات بیشتر با شرکت ایران ناژو تماس حاصل فرمائید .

 

مترجم : فرحناز حدیدساز – کارشناس ارشد شیمی –مسئول آزمایشگاه دستگاهی

             دکتر مریم شهیدی – مدیر آزمایشگاه کنترل کیفیت